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實時熒光定量PCR技術服務
更新時間:2019-08-16   點擊次數(shù):1547次

實時熒光定量PCR(RealTime PCR)技術服務

實時熒光定量PCR技術即是在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號實時監(jiān)測整個PCR進程,后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

實時熒光定量PCR避免了傳統(tǒng)PCR以終產物檢測定量產生的偏差,提高實驗的重復性。該技術已被廣泛用于檢測細胞mRNA表達量的變化;比較不同組織的 mRNA表達差異;驗證基因芯片,siRNA干擾的實驗結果等。

 

SYBR Green熒光染料法

SYBR Green是一種DNA結合染料,能非特異地摻入到雙鏈DNA中去。在游離狀態(tài)下,它不發(fā)出熒光,但一旦結合到雙鏈DNA中以后,便可以發(fā)出熒光。

它的大優(yōu)點就是可以與任意引物、模板相配合,用于任意反應體系中。從經濟角度考慮,它也比其它的探針的價格要便宜得多。但由于它能與所有的雙鏈DNA結合,所以一旦反應體系中出現(xiàn)非特異擴增,那它就會影響到定量結果的可靠性與重復性。

要避免這種不利因素,可以通過選擇良好的引物并優(yōu)化反應條件以消除非特異性影響。

 

TaqMan熒光探針法

PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。

探針完整時,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5-3外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。

即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產物形成*同步。

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